一、涂片、干燥、固定、初染(媒染）、脫色、復(fù)染??
(1)?涂片：臨床標(biāo)本或液體培養(yǎng)物可直接涂抹于潔凈的載玻片上，固體培養(yǎng)的細菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水，然后取菌少許在鹽水中磨勻，呈輕度混濁。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。?
(2)干燥??涂片最好在室溫下自然干燥，或?qū)?biāo)本面向上，置于酒精燈火焰高處慢慢烘干，切不可在火焰上燒干。?
(3)固定??細菌的固定常用火焰加熱法，即將上述已干的涂片在火焰中迅速通過3～5次，溫度以手能摸時熱而不燙為度。目的在于殺死細菌，凝固細胞質(zhì)，改變細菌對染料的通透性。?
(4)?初染：不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。?
(5)?媒染：通過媒染可增加染料和被染物質(zhì)的親和力。媒染劑還可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。?
(6)?脫色：此步驟主要目的是觀察細菌與染料間結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。?
(7)?復(fù)染：細菌初染色被脫色后常以復(fù)染液復(fù)染，便于觀察。復(fù)染液的顏色與初染液有明顯不同。??
二、常用染料原液配制?
?一般制備100ml純酒精飽和溶液所需染料量：美蘭2g～5g；結(jié)晶紫7g～14g；堿性復(fù)紅3g～7g。??
三、常用的染色方法?
1、單染色法??即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅染液。?
染液?：①呂氏美蘭液，美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成；②稀釋石炭酸復(fù)紅液??堿性復(fù)紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸餾水作10倍稀釋即成。?
2、菌種：大腸埃希菌普通斜面培養(yǎng)物。?
3、染色方法：于已做好的涂片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅染液，染色1min，以水沖洗至無顏色流下為止，自然干燥或以遠火烘干后鏡檢。?????
4、結(jié)果：以美蘭染色者菌體呈現(xiàn)蘭色；以稀釋石炭酸復(fù)紅染色的菌體呈現(xiàn)紅色。?
